CHO细胞瞬转常见问题指南！干货满满，一篇就够了！
2024.11.20
2024.11.20
| 收到细胞后应如何处理？ | 收到干冰运输的细胞后，建议立即解冻细胞，或将冻存管放在液氮中储存72小时以上，使细胞适应直到解冻，避免短期、极端的温度变化，不要在-80℃储存细胞。一旦解冻，应立即转移到透气的、无障碍摇瓶的预热培养基中，按照推荐的培养条件进行培养。 细胞在解冻时应具有较高的活率，并在解冻后应迅速恢复。传代2-3次后倍增时间即可达到17-20小时。外观呈块状或在3代内没有恢复正常生长的细胞不应使用。 |
| 使用其它品牌培养基冻存，可以直接使用思鹏培养基复苏吗？ | 建议使用冻存培养基复苏细胞，然后使用思鹏培养基进行传代，进入细胞驯化阶段。一般情况下，直接驯化即可，如果直接驯化细胞状态不佳，排除其他问题后可通过间接驯化调整宿主细胞状态。 |
| 按照标准操作流程复苏CHO-S细胞，但复苏后细胞没有生长，怎么办？ | 如果CHO-S细胞解冻后只获得相对较低的密度，并且没有生长，建议首先验证培养温度，以确保培养箱温度在建议范围之内。 与HEK293细胞相比，CHO-S细胞对较低温度耐受力相对较强，对高温更为敏感。即使细胞培养箱设置为36.5℃ , 振荡产生的热量也会使培养体系中的温度提高到CHO-S细胞的最佳温度以上。培养CHO-S细胞的最佳温度为36.5℃ 。如果怀疑有过热现象，请降低培养箱的温度，以达到最佳工作温度。如果细胞经历了高温，状态下滑，最好的做法是复苏一支新的细胞，而不是试图恢复在较高温度下培养的细胞。 |
| 复苏后多久才能使用细胞，适合传多少代？ | 以CHO-S细胞为例，在解冻后至少传代3次使细胞状态恢复，活化操作后即可进行转染。正常情况下，细胞在解冻后应迅速恢复，具有较高的活率。如果按照手册中的指导方法进行培养，细胞将至少可维持20代。 |
| CHO-S细胞的正常生长特征是什么？ | 复苏后的2-3代，CHO-S细胞的倍增时间约为17-20小时。当细胞在0.15-0.5×10^6cells/mL条件下培养时，在3或4天内，活细胞密度应约为4.0-6.0×10^6cells/mL。如未达到该生长特征，细胞培养条件需要进一步优化。 |
| 如果细胞在传代培养时超过了目标密度该如何处理？ | 通常情况下，目标细胞密度为4.0-6.0×10^6cells/mL，当细胞明显过度生长时（如细胞密度达到8.0-10.0×10^6cells/mL），建议将细胞以更高的密度（如0.6×10^6cells/mL)传代，及时测量细胞密度，调整接种密度，使细胞恢复正常传代。如果可能，不要使用过高密度的细胞进行种子传代。另外，由于CHO-S细胞是高密度细胞系，如果细胞尚未达到4.0-6.0×10^6cells/mL，不建议传代培养，因为这将随着时间的推移损害细胞生长。 |
| 传代过程中，CHO-S细胞发生结团现象怎么处理？ | 随着细胞接近高密度，可能出现一些微小的细胞团块；不要试图分解这些团块，在取用细胞悬液时避免细胞团块进入传代或转染步骤。 对于所有的细胞操作，只需旋转摇瓶来重新悬浮细胞。尤其在细胞密度较高时，不要摇晃或吹打细胞，否则会导致细胞性能下降。 |
| MetaCell® CHO基础培养基可以和PEI搭配试用吗？25K和40K的PEI有什么区别？ | MetaCell® CHO基础培养基可以搭配PEI使用，不同的转染试剂在不同的工艺平台中表现会有差异，应当测试后进行选择。 40K的PEI溶解度较好，可直接在水中溶解；转染效率更高，但细胞毒性较强；完全去丙酰化，因此其性能始终高效如一。 25K的PEI溶解度差,需要先把水调成弱酸性助其溶解，溶解后再用NaOH把pH调至中性，以及需要加热；转染效率更高，细胞毒性较低；有4-11%丙酰基残留，其能阻止聚合物主链与DNA结合，因此性能稳定性略低于40K PEI。 |
| FectoPRO®的最大用量为什么是3μL/mL？增加FectoPRO®的用量可以提高转染效率吗？ | FectoPRO®试剂是一种高效的转染试剂，过高的用量可能会对细胞造成毒害。因此在CHO-S瞬转实验中，6.0×10^6cells/mL的转染条件下建议使用量不高于3μL/mL。 通常情况下，可通过增加转染试剂的使用量提高转染效率，但需要警惕提高使用量造成的细胞毒害，并且需要同时调整DNA使用量。因此，如果使用其他转染条件，建议DOE测试后确定转染工艺。 |
| FectoPRO® Reagent-DNA以及PEI-DNA复合物制备有哪些操作注意点？ | 转染试剂与 DNA 的添加顺序可能影响转染效率，建议按照转染指南的推荐进行操作。使用其他转染试剂时，也应当按照供应商的推荐进行操作。 |
| 容器材质会对转染复合物的形成造成影响吗？ | 会产生影响。如果使用PC材质，阳离子聚合物会被PC材质静电吸附，干扰转染复合物的形成，因此建议使用PETG或PP材质进行转染复合物的制备。 |
| 质粒DNA为什么设置为0.8-1.5μg/mL？ | 通常情况下，0.8-1.5μg/mL的质粒用量即可满足转染需求。过多使用DNA可能导致更大的细胞毒性，若使用的DNA少于0.8μg/mL，会提高转染效率降低的风险。进行DNA用量调整时，建议同时调整转染试剂用量，具体数值应进行优化后再作为平台工艺使用。 |
| 关于轻、重链编码质粒的最佳抗体表达比例，有什么建议吗？ | 轻、重链编码质粒的最佳比例取决于质粒共转染到同一细胞时两条链的表达速率。CHO系统当中，大多数测试的抗体使用1:1的比例即可进行高效表达。因此，我们建议从1:1开始，根据特定分子的需要进行测试。首先将重链和轻链亚基分别克隆到载体中，然后优化两个质粒的比例。在某些情况下，轻、重链编码质粒的最佳抗体表达比例可能具有特异性，应当根据实际情况进行实验摸索。 |
| 降温操作需要注意哪些点？ | 直接调节培养箱温度进行冷却需要很长时间，并限制温度变化的有效性，而通过打开门来冷却培养箱可能会导致污染。因此，建议使用一个专用的32℃培养箱，移动摇瓶至32℃培养箱来完成降温操作。 |
| 应该在哪一天收集上清液？ | 对于稳定的蛋白质（如抗体），第9-10天即可收获，此时细胞活率应该仍然很高，理想情况下是70-80%或更高。对于容易降解或有毒的蛋白质，应该保持监测，以确定最佳的收获时间。 如果需要延长培养（超过D10），建议D8补糖，便于让细胞维持更好的状态。在收获时仍然保持高细胞活率有利于保证蛋白质质量，便于下游纯化。如果细胞活率不佳，应在活率低于60%之前进行收获。具体的收获时间可依据蛋白质产量和细胞活率决定。 |
| 对于难表达的蛋白质，可以使用什么方式提高表达量？ | 除了进行工艺优化外，可以尝试使用更高效的转染试剂，例如FectoPRO®。通常情况下FectoPRO®搭配低水平的DNA用量即可进行高效表达。具体工艺可根据实际情况进行实验摸索。 |
| 使用FectoPRO®转染试剂，蛋白产量和转染效率仍然低，应如何优化转染条件？ | 建议测试以下方案：加大质粒DNA用量到1.5µg/ mL；增加FectoPRO®用量到3 µL/ µg DNA；调整转染复合物制备时稀释液的用量。具体工艺可根据实际情况进行实验摸索。 |
| 使用FectoPRO®转染试剂，细胞毒性过大应如何优化转染条件？ | 建议测试以下方案：降低质粒DNA用量到0.4µg/ mL；减少转染试剂用量到1 µL/ µg DNA；减少MetaCell® Titer Enhancer用量；提前降温；增加转染复合物制备时稀释液的用量。具体工艺可根据实际情况进行实验摸索。 |
| CHO-S转染实验是否需要额外添加抗结团剂？ | 如果使用MetaCell® CHO Transfectory瞬时蛋白表达系统，一般情况下不需要额外添加抗结团剂， MetaCell® CHO TransFeed含有一定量的抗结团试剂，在保证转染效率的同时，最大化缓解结团的情况。如需增加抗结团剂的用量，应进行实验摸索。 |
| 是否需要添加VPA？ | 正常情况下无需额外添加其他小分子试剂，如需添加，应进行实验摸索。 |
| 下游经常出现镍柱掉镍，蛋白不纯的情况，如何改进? | 建议使用耐受EDTA的镍柱，如GE的Ni Excel；使用不含EDTA的培养基，如思鹏生物培养基。 |
| CO2的作用以及设置范围？ | CO2的主要作用是调节酸碱度，培养基中含有碳酸氢钠可以作为缓冲buffer，过高或没有CO2会破坏缓冲功能。一般建议将CO2设置为5-8%。 |